Hintergrund
Die Erweiterung des genetischen Codes mittels orthogonaler Aminoacyl-tRNA-Synthetase/tRNA-Paare ist ein etabliertes Werkzeug der synthetischen Biologie. Bekannte PylRS-basierte Systeme leiden jedoch unter geringer katalytischer Effizienz, insbesondere beim Mehrfacheinbau von ncAAs. Dies limitiert sowohl die Ausbeute als auch die industrielle Nutzbarkeit.
Technische Beschreibung
Die vorliegende Erfindung adressiert diese Limitation durch die Entwicklung einer hochaktiven, psychrophilen PylRS-Variante aus M. burtonii mit gezielten Mutationen im katalytischen Zentrum. Damit wird es möglich, rekombinante Proteine gezielt mit zusätzlichen chemischen Funktionen auszustatten, die mit herkömmlichen biotechnologischen Verfahren nicht oder nur sehr ineffizient zugänglich sind. Das stark verbesserte Enzym sorgt während der Proteinherstellung in der Zelle dafür, dass sogenannte nicht-kanonische Aminosäuren (ncAAs) zuverlässig und effizient in Proteine eingebaut werden. Diese ncAAs tragen besondere chemische Gruppen, z.B. für Kopplungsreaktionen, Markierungen oder lichtaktive Funktionen.
Die Effizienz der Technologie wurde bereits in E. coli und in humanen HEK293T-Zellen validiert.
Anwendungsmöglichkeiten
• Herstellung rekombinanter Proteine mit definierten chemischen Funktionen, z. B. photo-reaktive, klick-chemische oder konjugierbare Gruppen
• Protein-Drug-Konjugate (PDCs) und Protein-Protein-Konjugate
• Site-spezifische Markierung von Proteinen für biophysikalische und zellbiologische Analysen
• Photo-Crosslinking-Studien zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen (z.B. mittels Photo-Leucin)
• Plattformtechnologie für synthetische Biologie, Proteinengineering und funktionelle Proteomik
Schematische Darstellung der Technologie. (© N. Koch)
